近年来，抗生素的过度使用，导致在多种食物中检测到抗生素耐药菌的存在，对人类健康造成潜在威胁，故开发不易产生耐药性的天然生物防腐剂具备极其重大意义。IIa类细菌素具有着强烈抑菌活性，有良好的pH值稳定性，易被人体内蛋白酶降解等特点，已成为天然食品防腐剂研究与开发的热点。大肠杆菌（Escherichia coli）表达外源蛋白具有成本低、周期短、产率高等优点，因此，开展IIa类细菌素在E. coli中的表达研究具备极其重大实践意义。 本实验室前期从发酵鱼中筛选得到 1 株植物乳杆菌 （ Lactobacillus plantarum ） LPL-1 ，其所产细菌素为新的 IIa 类细菌素，因含有 2 个二硫键，该细菌素不仅对李斯 特菌表现出强烈抑菌活性，而且拥有非常良好的稳定性，具 有作为天然食品生物防腐剂的应用潜力。
中国农业大学食品科学与营养工程学院的王玉、王瑶和李平兰*研究以植物乳杆菌素LPL-1为研究对象，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术改变E. coli细胞质中的还原环境构建适宜IIa类细菌素表达的细胞工厂，产生的细菌素不一定要通过切除融合标签实现活性，可以优化细菌素的纯化步骤，解决植物乳杆菌素LPL-1在E. coli中的包涵体表达问题，旨在为IIa类细菌素的异源表达及包涵体问题提供了新的解决策略。
如图1所示，L. plantarum LPL-1基因组信息数据显示，植物乳杆菌素LPL-1基因大小为126 bp，用引物LPL-F、LPL-R扩增得到的植物乳杆菌素LPL-1基因片段大小在100～250 bp之间，连接至pWL-A表达载体，对重组子进行测序验证，得到含有正确克隆的表达载体pWL-A-LPL-1，可用于后续的蛋白表达。
构建的trxB-gRNA与trxB打靶片段成功转入含有pCAS质粒的E. coil BW25331菌株中。trxB基因长度为966 bp，用横跨trxB基因500 bp的上下游引物进行检验确定，正确敲除trxB后，扩增产物为500 bp，未敲除trxB基因扩增产物长度为1 466 bp；以同样的方法对gor基因进行敲除和鉴定，基因gor长度为1 353 bp，gor基因敲除后，扩增产物长度为500 bp，gor未敲除扩增产物长度为1 853 bp。如图2所示，通过核酸电泳分析发现，基因trxB与gor敲除成功，基因测序后未发现基因突变，因此得到敲除菌株E. coil（ΔtrxB）和E. coil（Δgor），可用于重组植物乳杆菌素LPL-1的表达。
E. coli中氧化还原反应两个关键基因trxB和gor同时缺失会导致菌体死亡，而细胞质内ahpC基因突变（TTCTACCC→TTCTCTTACCC）能够大大减少过氧化氢和烷基氧化物的积累，保护细胞免受损伤，进而抑制菌体的死亡。构建的ahpC-gRNA质粒与ahpC打靶片段成功转入含有pCAS质粒的E. coil BW25331菌株中。如图3所示，通过基因测序，成功筛选到含有正确突变体的目标菌株。在此突变株基础上分别对trxB和gor基因进行敲除，最终成功获得基因敲除菌株E. coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpC M ），可用于重组植物乳杆菌素LPL-1的表达。
构建成功的表达载体pWL-A-LPL-1分别转化至E. coli BW25113、E. coil（ΔtrxB）、E. coil（Δgor）和E. coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）进行表达分析，将诱导表达后的菌体进行超声破碎，利用Tricine-SDS-PAGE对超声破碎后的上清液与沉淀做多元化的分析，由图4可知，以E. coli BW25113为宿主时，只有沉淀中可观察到目的条带（5.2 kDa），由此说明植物乳杆菌素LPL-1在野生型菌株中主要以包涵体形式表达；植物乳杆菌素LPL-1以敲除菌株E. coil（ΔtrxB）和E. coil（Δgor）为表达宿主时，在上清液中可见痕量表达，但细菌素仍大量以包涵体形式存在于沉淀中；当细菌素在E. coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）中诱导表达时，可以明显观察到上清液中目的蛋白的表达量增多，由此说明构建的基因工程菌E. coil（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）有利于植物乳杆菌素LPL-1的正确折叠，促进了细菌素的可溶性表达，进一步以该菌株为表达宿主，对上清液中的植物乳杆菌素LPL-1进行纯化与活性分析。
如表2和图5所示，细菌裂解上清液的比活力为193.26 AU/mg，重组植物乳杆菌素LPL-1带有His标签可以用Ni-NTA柱进行纯化，经10 mmol/L咪唑洗脱杂蛋白，300 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，共出现两个洗脱峰，利用Tricine-SDS-PAGE对峰1和峰2做多元化的分析，重组蛋白的分子质量为5.2 kDa，在峰2大量出现且纯度较高。收集峰2的目的蛋白进行抗菌活性验证，其比活力为2 542.35 AU/mg。超滤管对峰2目的蛋白脱盐处理后的比活力为2 690.62 AU/mg。虽然纯化后的重组细菌素比活力不如天然植物乳杆菌素LPL-1（5 541.66 AU/mg），但其回收率却远超天然细菌素（2.08%）和需要切除融合标签的重组细菌素（5.75%），这可能是由于重组细菌素含有His标签，某些特定的程度影响细菌素的活性，但因避免了繁琐的纯化步骤，所以提高了回收率。
如表3所示，重组植物乳杆菌素对L. monocytogenes、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌等革兰氏阳性菌表现出明显抑菌活性，与天然植物乳杆菌素和其他植物乳杆菌中分离的IIa类细菌素一致，重组细菌素不能抑制革兰氏阴性菌和真菌的生长。以上结果说明用此方法表达的重组细菌素能够很好地保留天然细菌素的抑菌特性。
细菌素对温度的敏感性强弱是衡量其在饮食业潜在应用价值的标准。由图6A可知，外源表达的植物乳杆菌素LPL-1在60 ℃分别处理10 min与30 min后，其抗菌活性能保持90%以上，经80 ℃分别处理10 min与30 min，抗菌活性能保持80%以上，经100 ℃分别处理10 min与30 min，抗菌活性能保持65%以上，与天然合成的植物乳杆菌素LPL-1和植物乳杆菌素J23[25]相似，说明该重组细菌素具有非常好的耐热性，在巴氏灭菌及需要高温灭菌的食品中具有一定的应用潜力。
不同细菌素适用的pH值范围不同，大多数乳酸菌细菌素在低pH值条件下抑菌活性最高，在pH 7以上时，抑菌活性减弱或丧失。例如，Nisin在酸性条件下抑菌效果最好，但在中性或碱性条件下活性丧失。而重组植物乳杆菌素LPL-1与天然合成的植物乳杆菌素LPL-1和其他植物乳杆菌素相似，如图6B所示，在pH 2～7范围内仍保持90%以上活力，pH 8～10范围内仍保持50%～70%的活力，说明该细菌素有很好的pH值稳定性，在酸性、中性及弱碱性食品中具有一定的应用潜力。
表面活性剂常用作食品乳化剂应用于食品制造业中。由图6C能够准确的看出，尿素、EDTA、Tween-20和Tween-80对重组植物乳杆菌素LPL-1的抗菌活性影响很小，均能保持90%以上的抗菌活性，与天然合成的植物乳杆菌素LPL-1和植物乳杆菌素K25类似，由此说明重组细菌素在乳化食品中具有一定应用潜力。
IIa类细菌素是乳酸菌细菌素中顶级规模、研究最广泛的一个类别，由于其稳定的理化性质和对食源性致病菌的强抑菌活性，已成为生物防腐剂中最有希望的候选物。天然IIa类细菌素产量低且不易于分离纯化，以E. coli为宿主表达时，由于其二硫键的存在又极易形成包涵体。
本研究通过 CRISPR / Cas9 基因编辑技术以E. coli BW25331为底盘菌株，构建了3 种不同基因型的表达宿主。植物乳杆菌素LPL-1在野生型E. coli BW25331中主要以包涵体形式出现；在E. coli BW25113（ΔtrxB）与E. coli BW25113（Δgor）中以可溶性形式痕量出现于上清液中，但多数仍以包涵体形式存在；当植物乳杆菌素在E. coli BW25113（ΔtrxB＋Δgor＋ahpCM）中表达时，在上清液中观察到大量细菌素的出现，由此解决了植物乳杆菌素LPL-1的包涵体表达问题。将外源表达的植物乳杆菌素LPL-1经镍柱纯化后，得到的重组细菌素与天然细菌活性相似，在不同pH值（2～11）、温度（60～100 ℃）及表面活性剂处理后仍保持比较高的活性，并对多种食源性致病菌具有抑菌活性，说明外源表达的植物乳杆菌素LPL-1在食品领域有很广泛的应用潜力。
本研究对IIa类细菌素异源表达的探索以及理化特性分析可为细菌素的工业化生产及其在食品安全领域应用提供一定数据支持。
本文《植物乳杆菌素LPL-1的异源表达及理化性质分析》来源于《食品科学》2023年44卷第20期100-106页，作者：王玉, 王瑶, 李平兰。DOI:10.7506/spkx1130-354。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。
责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。
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